کروماتوگرافی (Chromatography) روشی تحلیلی است برای جداسازی اجزای یک مخلوط شیمیایی به وسیله عبور دادن یک فاز متحرک از روی یک فاز ساکن میباشد. فرض کنید که دو واکنش‌دهنده A و B داشته باشیم و آن‌ها را با یکدیگر وارد واکنش کنیم تا فرآورده‌ی C را تولید کنند. در پایان واکنش، مخلوطی از فرآورده C و واکنش‌دهنده‌های A و B داریم که در واکنش شرکت نکرده‌اند. کروماتوگرافی به ما کمک می‌کند تا واکنش‌دهنده‌ها و فرآورده‌ها را در مخلوط از یکدیگر جدا کنیم و به خوبی بتوانیم فرآورده C را مورد بررسی قرار دهیم.

روش کروماتوگرافی در علم شیمی و آزمایشگاه کاربرد بسیاری دارد. در ادامه از این مطلب نور صنعت فردوس این روش را به طور کامل بررسی میکنیم.

کروماتوگرافی

کروماتوگرافی چیست ؟

همانطور که گفته شد؛ کروماتوگرافی روشی در شیمی است که به وسیله آن میتوان اجزای یک مخلوط را از هم جدا کرد. در این روش با گذراندن مخلوط مایع یا گازی از یک لوله یا شبکه، مخلوط به اجزای تشکیل دهنده تجزیه میشود و هر جزء جداگانه از شبکه خارج میشود. جدا شدن اجزای تشکیل دهنده مخروط به دلیل اختلاف سرعت حرکت اجزای مختلف یک مخلوط درون شبکه است.

در کروماتوگرافی دو فاز وجود دارد، فاز ثابت و فاز متحرک. فاز ثابت در واقع اجزای درون لوله یا شبکه جداسازی را تشکیل می‌دهند. فاز متحرک مربوط به ماده‌ای است که می‌خواهد مورد تجزیه و تخلیص قرار بگیرد.

کروماتوگرافی یک اصطلاح کلی است که در آزمایشگاه‌ ها برای جداسازی ترکیبات استفاده می‌شود. این ترکیب در مایعی به نام فاز متحرک حل شده ‌است و توسط ساختار دیگری به نام فاز ثابت نگهداری می‌شود. اجزای مختلف این ترکیب با سرعت‌های مختلفی حرکت می‌کنند و همین امر باعث جداسازی این ذرات می‌شود.

 

تاریخچه 

کروماتوگرافی لغتی یونانی به معنی رنگ نگاری است. و ترکیبی از دو واژه “کروما” به معنی رنگ و “گروفین” به معنی نوشتن است. کروماتوگرافی برای اولین بار در سال ۱۹۰۰ توسط دانشمند ایتالیایی میخائیل تسو در روسیه به کار گرفته شد. وی در دهه اول قرن بیستم کروماتوگرافی را در وهله اول برای جداسازی رنگدانه‌های گیاهی مثل کلروفیل، کاروتن و زانتوفیل‌ها به کار گرفت. از آنجا که این ترکیبات دارای رنگ‌های مختلف (سبز، نارنجی و زرد) هستند، اسم این روش به کروماتوگرافی معروف شد.

انواع جدید روش‌های جداسازی که در دهه ۱۹۳۰ و ۱۹۴۰ توسعه یافتند، این روش را به روشی کارآمد در بسیاری از فرایند‌های جداسازی تبدیل کرده‌اند. روش کروماتوگرافی به دلیل تلاش‌های آرچر جان پورت مارتین و ریچارد لورنس میلینگتون سینگ در طول دهه ۱۹۴۰ و ۱۹۵۰ به طور چشم‌گیری توسعه یافت که منجر به دریافت جایزه نوبل شیمی در سال ۱۹۵۲ شد. آنها اصول و روش‌های اساسی کروماتوگرافی تقسیمی را که سبب توسعه چندین روش جداسازی مانند: کاغذی، گازی و مایع با کارایی بالا شد، بنا نهادند. در حال حاضر این روش به سرعت در حال پیشرفت است.  محققان به طور مداوم در حال بهبود عملکرد فنی آن هستند و هم‌اکنون امکان جداسازی مولکول‌های مشابه بیشتری را فراهم می‌کنند.

 

اصطلاحات رایج :

قبل از ادامه مطلب، لازم است با چند اصطلاح رایح کروماتوگرافی آشنا شویم.

  • آنالیت: ترکیبی است که مد نظر و مورد شناسایی ما بوده و باید از مخلوط جداسازی شود.
  • فاز متحرک: فازی است که نمونه را در طول جداسازی با خود حمل می‌کند. می‌تواند بسته به نوع روش به شکل گاز یا مایع باشد.
  • فاز ساکن: فازی است که با پیوندی از نوع کووالانسی به ذرات پشتیبان یا به درون دیواره ستون کروماتوگرافی متصل شده‌اند. می‌تواند بسته به نوع روش به شکل جامد یا مایع باشد.
  • کروماتوگرام: یک خروجی بصری به شکل یک نمودار است که از ترسیم پاسخ آشکارساز به صورت تابعی از زمان یا حجم فاز متحرک حاصل می‌شود.
  • آشکارساز: اشاره به ابزاری دارد که برای آشکار‌سازی کمی و کیفی آنالیت‌ها بعد از جداسازی مورد استفاده قرار می‌گیرند.
  • زمان بازداری: مدت زمانی است که طول می‌کشد تا آنالیت به آشکارساز برسد و شناسایی شود. این زمان در کروماتوگرام با tR نشان داده می‌شود.
  • زمان مرده: زمان بازداری یک گونه فرضی است که اصلا در فاز ساکن نگه داشته نمی‌شود. به عبارتی tM زمان بازداری فاز متحرک است.
  • ثابت توزیع: نسبت غلظت گونه در فاز ساکن به غلظت گونه در فاز متحرک است. هرچه مقدار k بیشتر باشد یعنی زمان ماندگاری در فاز ساکن بیشتر بوده و دیرتر شناسایی می‌شود.

 

روش های کروماتوگرافی

روش‌ های کروماتوگرافی را می‌توان ابتدا بر حسب ماهیت فاز متحرک و سپس بر اساس ماهیت فاز ساکن طبقه‌بندی کرد. فاز متحرک ممکن است گاز یا مایع و فاز ساکن ممکن است جامد یا مایع باشد. اگر فاز ساکن جامد باشد کروماتوگرافی را جذب سطحی و اگر فاز ساکن، مایع باشد کروماتوگرافی را تقسیمی می‌نامند.

 

انواع کروماتوگرافی

به طور کلی 4 نوع اصلی کروماتوگرافی وجود دارد :

  1. مایع جامد
  2. گاز جامد
  3. مایع مایع
  4. گاز مایع

 

1. کروماتوگرافی مایع جامد (LSC)

در این روش جدا شدن بر اساس جذب سطحی یا تشکیل کمپلکس است. کروماتوگرافی LSC در واقع نوعی کروماتوگرافی جذبی است که مواد بر اساس اختلاف در قابلیت جذب خود روی سطح جامد از یکدیگر جدا می‌شوند. این روش نیز به انواع مختلفی چون جذب سطحی (برای جدا کردن مواد شیمیایی غیر مشابه) ، لایه نازک، تبادل یونی و ژلی تقسیم می‌شود.

 

  • کروماتوگرافی لایه نازک

این نوع جداسازی برای مقادیر بسیار کم کاربرد دارد. در این کروماتوگرافی فاز ساکن جامد و فاز متحرک مایع می‌باشد. عملکرد کروماتوگرافی لایه نازک نیز مانند سایر روش‌های کروماتوگرافی است. اجزای فاز متحرک بر روی سطحی از یک فاز ساکن حرکت می‌کنند. این حرکت به گونه‌ای است که ترکیبات با تمایل جذب (چسبندگی) بیشتر، نسبت به ترکیبات با تمایل جذب کمتر، با سرعت پایین‌تری حرکت می‌کنند و در اثر این اتفاق، جداسازی انجام می‌‌گیرد. به هنگام اتمام فرآیند جداسازی،‌ هر یک از ترکیبات مخلوط به صورت نقطه‌ای در سطوح مختلف در لایه (پلیت) کروماتوگرافی ظاهر می‌شوند تا مشخصه‌های ترکیب و طبیعت آن‌ها بررسی شوند.

 

  • کروماتوگرافی تبادل یونی

کروماتوگرافی تبادل یونی از انواع جداسازی های جذبی می باشد که در آن، معمولا از رزین به جای جاذب استفاده می‌ کنند. تفکیک و جداسازی در واقع در ستونی که با یک ماده تعویض یونی پر شده است انجام می شود. ماده پر کننده ستون را فاز ثابت و حلالی که از ستون کروماتوگرافی عبور می کند را فاز متحرک می نامند.

تبادل یونی متداول ترین تکنیک جهت خالص سازی پروتئین ها و سایر بیومولکول های باردار (مانند اسید نوکلئیک ها و اسید های آمینه) می باشد. فرآیند جداسازی این بیو مولکول ها بر اساس نوع بار خالص و بزرگی بار آنها می باشد. علاوه بر آن جهت تفکیک، جداسازی و اندازه گیری یون های معدنی همچون اکتنید ها و لانتانید ها نیز کاربرد دارد.

نحوه عمل کروماتوگرافی تبادل یونی نیز مثل سایر تکنیک ‌های کروماتوگرافی می باشد. بدین صورت که اجزای فاز متحرک که معمولا محلول بوده و شامل نمونه با اجزا قابل یونیزه است، بر روی ستون پر شده که باردار است حرکت می ‌کند. در این روش بین دو فاز ساکن و متحرک به صورت تعادلی و برگشت پذیر، تبادل و تعویض یون انجام می گیرد. همانطور که بیان شد، این روش بر اساس بار یون ها کار می کند. در حقیقت، بار فاز ثابت با بار مخالف خود در فاز متحرک، تعویض می گردد .

 

  • کروماتوگرافی ژلی

در کروماتوگرافی ژلی ، فاز ساکن از یک قالب بسپار متخلخل تشکیل شده است که منفذهای آن بوسیله حلالی که به عنوان فاز متحرک بکار می‌رود، کاملا پر شده است. اندازه سوراخ بسیار مهم است چون اساس جدایی بر این است که مولکولی‌های بزرگتر از یک اندازه معین اصلا وارد سوراخ‌ها نشوند و تمام یا قسمتی از سوراخ‌ها برای ورود مولکول‌های کوچکتر آماده است. جریان فاز متحرک موجب می‌شود که مولکول‌های بزرگتر بدون برخورد با مانعی ، بدون نفوذ در قالب ژل از ستون عبور کنند. در حالی‌که مولکول‌های کوچک‌تر بر حسب شدت نفوذ آنها در ژل در ستون نگه داشته می‌شوند.

 

2. کروماتوگرافی گاز جامد (GSC)

یکی از روش ‌ها که برای بررسی و جداسازی مواد فرار بدون تجزیه شدن آن‌ ها، بکار می‌رود؛ کروماتوگرافی گازی است. فاز گازی یک گاز بی اثر ( برای مثال هلیوم، نیتروژن، آرگون و دی اکسید کربن)  است و به فاز متحرک گاز حامل نیز می‌گویند. فاز ساکن یک جسم جامد جاذب یا لایه نازکی از یک مایع غیر فرار است که به دیواره داخلی ستون یا به صورت پوششی روی سطح گلوله ‌های شیشه ای یا فلزی قرار داده شده‌ است. در صورتی که فاز ساکن جسم جامد جاذب باشد اصطلاحاً کروماتوگرافی گازی گویند.  اگر فاز ساکن مایع غیر فرار باشد آن را کروماتوگرافی گاز مایع گویند.

اما هر دو به جداسازی گازی معروف هستند. در کروماتوگرافی گازی، جداسازی اجزا یک مخلوط متناسب با میزان توزیع اجزا تشکیل دهنده مخلوط بین فاز متحرک گازی و فاز ساکن جامد یا مایع صورت می گیرد. در این روش گاز حامل مخلوط را درون ستون حرکت می دهد و بین دو فاز در حالت تعادل (گاز-مایع) اجزا تشکیل دهنده مخلوط توزیع می ‌شوند. بنابراین فاز متحرک اجزا تشکیل دهنده نمونه را به طرف بیرون ستون حرکت می دهد و هر مولکولی که با ارتباط سست ‌تر جذب ستون شده‌ است، زودتر و جزئی که قدرت جذب بیشتری با ستون دارد، دیرتر از ستون خارج می‌شوند. بنابراین، اجزا مخلوط از یکدیگر جدا می‌شوند. کروماتوگرافی گازی برای جداسازی و شناسایی اجزا تشکیل دهنده یک مخلوط و تجزیه کمی آن ‌ها نیز کاربرد دارد.

 

3. کروماتوگرافی مایع – مایع (LLC)

به دو گونه تقسیمی (برای جدا کردن مواد شیمیایی مشابه) و کاغذی استفاده می شود.

 

  • کروماتوگرافی تقسیمی

در جداسازی مواد بوسیله کروماتوگرافی تقسیمی، شیوه کار بسیار شبیه به شیوه جذب سطحی است. اختلاف اصلی دو روش در ماهیت ماده پر شده در ستون است. سرعت حرکت یک جزء از مخلوط تابع انحلال پذیری آن در فاز ساکن است. به عبارت دیگر ، جدا شدن اجزا بر اساس تقسیم بین دو مایع است. اجسامی که بیشتر حل می‌شوند، کندتر از اجسامی که کمتر حل می‌شوند به طرف پایین ستون حرکت می‌کنند. در جریان عبور از ستون ، اجسام میان دو فاز تقسیم می‌شوند و جداسازی مواد بر اساس اختلاف میان ضرایب تقسیم آنها انجام می‌شوند.

 

  • کروماتوگرافی کاغذی

کروماتوگرافی کاغذی از جمله روش‌های جداسازی مواد به شمار می‌آید که برای جداسازی از یک کاغذ (نوار کاغذی) به عنوان فاز ساکن بهره می‌گیرد. کروماتوگرافی کاغذی روشی ارزان‌ قیمت برای جداسازی مواد شیمیایی از یکدیگر است. این جداسازی بر اساس سرعت متفاوت حرکت مواد در طول کاغذ انجام می‌گیرد. علاوه بر این، ابزار تحلیلی قدرتمندی است که از مقادیر کم مواد شیمیایی استفاده می‌کند.

اصول کروماتوگرافی کاغذی را می‌توان شامل اصول «تقسیمی و «جذب سطحی» دانست چرا که مواد بین فازهای مایع تقسیم یا توزیع می‌شوند. فازهای موجود، آب موجود در حفرات کاغذ فیلتر و فاز دیگر نیز، نوعی فاز متحرک است که از کاغذ عبور می‌کند. همانند سایر روش‌ها، فاز متحرک از میان فاز ساکن عبور می‌کند و اجزای مخلوط‌ها با آن حمل می‌شوند. در ادامه، اجزای مختلف با سرعت‌های متفاوتی در طول کاغذ حرکت می‌کنند.

 

4.کروماتوگرافی گاز- مایع (GLC )

کروماتوگرافی ستون مویین از این نوع است.  در LLC و GLC ، مواد بر اساس توزیع بین دو فاز جدا می‌شوند. برای انتخاب نوع روش جداسازی ابتدا روش‌های ساده‌تر مانند کروماتوگرافی کاغذی و لایه نازک امتحان می شوند. اگر پاسخگو نباشد به سراغ روش‌های پیچیده‌تر مانند روش مایع با کارایی بالا (HELC) می‌رویم.

 

انتخاب بهترین روش

انتخاب نوع روش جداسازی بجز در موارد واضح (مانند کروماتوگرافی گازی در جداسازی مواد گازها) عموماً تجربی است. زیرا هنوز هیچ راهی جهت پیش‌بینی بهترین روش برای جداسازی مواد اجسام مگر در چند مورد ساده وجود ندارد. در ابتدا روش‌های ساده‌تر مانند کروماتوگرافی کاغذی و لایه نازک امتحان می‌شوند. زیرا این روش‌ها در صورتی که مستقیماً قادر به جداسازی مواد نباشند نوع سیستم کروماتوگرافی را که جداسازی مواد به وسیلهٔ آن باید صورت بگیرد، مشخص می‌کنند. آنگاه در صورت لزوم از روش‌های پیچیده‌تر استفاده می‌شود.

اشتراک گذاری:

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *