محیط کشت

محیط کشت 

محیط کشت یکی از مهمترین عوامل تاثیر گذار در کشت بافت و یا کشت سلولی است. کشت سلولی ( بافت ) یکی از اصلی ترین تکنیک ها در علوم آزمایشگاهی، کشاورزی و پزشکی است. در کشت سلولی(بافت) قطعه ای از بافت ها یا سلول های بدن یک گیاه و یا حیوان، تحت شرایط خاص جدا شده و وارد یک محیط مصنوعی که برای بقا و رشد آنها مناسب است میشود. این محیط مصنوعی مناسب برای بقا و رشد، محیط کشت نام دارد. اصلی ترین و مهمترین مرحله در کشت سلولی (بافت) انتخاب محیط رشد مناسب برای کشت آزمایشگاهی است.

محیط رشد یا محیط کشت ، مایعی یا ژلی است که برای رشد میکروارگانیسم ها ، سلول ها یا گیاهان کوچک طراحی شده است. محیط کشت سلول به طور کلی منبع مناسبی از انرژی و ترکیباتی است که چرخه سلول را تنظیم می کند. یک محیط کشت معمولی از مکمل اسیدهای آمینه ، ویتامین ها ، نمک های غیر آلی ، گلوکز و سرم به عنوان منبع عوامل رشد ، هورمون ها و عواملی دیگر تشکیل شده است. علاوه بر مواد مغذی ، محیط به حفظ PH و اسمولالیته نیز کمک می کند.

 

تاریخچه

میکروب شناسی به لطف کشف و بهینه سازی محیط های کشت تا حد زیادی توسعه یافته است. اولین محیط کشت مصنوعی مایع توسط لوئیس پاستور در سال 1860 ایجاد شد. پیش از این ، رشد باکتری ها در مواد روزانه مانند برخی غذاها مشاهده شده بود. این مشاهدات اهمیت محیط طبیعی باکتریها و نیازهای تغذیه ای آنها را در ایجاد محیط کشت برای جداسازی آنها برجسته می کند. یک محیط کشت اساساً از عناصر اساسی (آب ، مواد مغذی) تشکیل شده است که باید فاکتورهای مختلف رشد را نیز اضافه کرد که مخصوص هر باکتری خواهد بود و برای رشد آنها لازم است.

تکامل کشت باکتریایی از طریق مواد مورد استفاده برای کشت آنها با توسعه اولین محیط کشت جامد توسط کوچ آغاز شد. نه تنها تولید کلنی های باکتریایی ، بلکه امکان تصفیه یک کلون باکتریایی نیز فراهم شد. عامل اصلی ژل زنی مورد استفاده در محیط کشت جامد ، آگار است.

با این حال ، برخی از محدودیت ها در استفاده از آگار به دلیل برخی از باکتری های بسیار حساس به اکسیژن که در محیط آگار رشد نمی کنند ، مشاهده شده است و گزینه های دیگری پیشنهاد و آزمایش شده است. سپس ، کشف عوامل ضد میکروبی و اهداف خاص آنها ظهور مواد های انتخابی را افزایش داد. این عوامل بازدارنده امکان از بین بردن باکتریهای نامطلوب از میکروبیوتا و انتخاب باکتریهای مورد نظر را فراهم می کند. به لطف شناخت بهتر از محیط باکتریایی ، امکان ایجاد محیط کشت جدید و شرایط کشت جدید ، سازگارتر با برخی از باکتریهای سریع که جداسازی دشوار است، وجود خواهد داشت.

محیط کشت آگار

اجزای محیط کشت

محیط کشت حاوی مخلوطی از اسیدهای آمینه ، گلوکز ، نمک ها ، ویتامین ها و سایر مواد مغذی است. آنها به صورت پودر یا به صورت مایع در دسترس هستند. الزامات مورد نیاز این اجزا در رده های سلولی متفاوت است. این تفاوت ها تعداد گسترده ای از فرمولاسیون ها را به وجود می آورند. هر جزء عملکرد خاصی را انجام میدهد که در زیر به آنها اشاره خواهیم کرد.

 

سیستم های بافر

تنظیم pH برای شرایط بهینه کشت بسیار مهم است و به طور کلی توسط یکی از دو سیستم بافر به دست می آید:

سیستم بافر طبیعی

در یک سیستم بافر طبیعی ، CO2 گازی با محتوای CO3 / HCO3 محیط کشت تعادل پیدا می کند. فرهنگ هایی که دارای سیستم بافر طبیعی هستند ، باید در جو هوا با 5-10٪ CO2 ، که معمولاً توسط اتاق کشت بافت CO2 نگهداری می شوند ، حفظ شوند. یک سیستم بافر طبیعی کم هزینه و غیر سمی است.

HEPES

بافر شیمیایی با استفاده از یک zwitterion ، HEPES ، دارای ظرفیت بافر برتر در محدوده pH 7.2-7.4 است و به جو گازی کنترل شده نیاز ندارد [16]. HEPES برای بعضی از انواع سلول ها در غلظت بالاتر نسبتاً گران و سمی است. همچنین نشان داده شده است که HEPES حساسیت محیط به اثرات سمیت ناشی از قرار گرفتن در معرض نور فلورسنت را تا حد زیادی افزایش می دهد.

 

فنول قرمز

بیشتر محیط های کشت تجاری موجود شامل فنل قرمز به عنوان یک شاخص pH است که امکان کنترل مداوم pH را فراهم می کند. در طول رشد سلول ، با تغییر pH به دلیل متابولیت های آزاد شده توسط سلول ، محیط تغییر رنگ می دهد. در سطوح pH پایین ، فنول قرمز محیط متوسط ​​را زرد می کند. در حالی که در سطح pH بالاتر ، محیط ​​را بنفش می کند. متوسط ​​pH 7.4 ، قرمز روشن ، مقدار مطلوب pH برای کشت سلول است. با این حال ، معایب خاصی در استفاده از فنل قرمز وجود دارد که در زیر توضیح داده شده است:

  • توصیه می شود برای مطالعات با استفاده از سلولهای حساس به استروژن مانند بافت پستانی ، از محیط بدون فنول قرمز استفاده شود.
  • وجود فنول قرمز در برخی از فرمولاسیون های بدون سرم با هموستاز سدیم-پتاسیم تداخل می کند. این اثر را می توان با قرار دادن سرم یا هورمون هیپوفیز گاو در محیط خنثی کرد.
  • فنول قرمز در مطالعات فلوسیتومتری در تشخیص اختلال ایجاد می کند.

 

نمک غیر آلی

نمک غیر آلی موجود در محیط با تأمین یون های سدیم ، پتاسیم و کلسیم به حفظ تعادل اسمزی کمک می کند و به تنظیم پتانسیل غشا کمک می کند.

 

آمینو اسید

اسیدهای آمینه عناصر سازنده پروتئین ها هستند. از این رو مواد اجباری تمام محیط های کشت سلولی شناخته شده هستند. اسیدهای آمینه ضروری باید در محیط کشت قرار گیرند زیرا سلولها نمی توانند به تنهایی اینها را سنتز کنند. آنها برای تکثیر سلول ها مورد نیاز هستند و غلظت آنها حداکثر تراکم سلول قابل دستیابی را تعیین می کند.

ال-گلوتامین ، یک اسید آمینه ضروری ، به ویژه مهم است. ال-گلوتامین نیتروژن را برای NAD ، NADPH و نوکلئوتیدها فراهم می کند و به عنوان منبع انرژی ثانویه برای متابولیسم عمل می کند. ال-گلوتامین یک آمینو اسید ناپایدار است که با گذشت زمان به شکلی تبدیل می شود که توسط سلول ها قابل استفاده نیست و بنابراین باید دقیقاً قبل از استفاده به محیط اضافه شود. هنگام افزودن L-glutamine بیشتر از آنچه در فرمولاسیون اصلی ماده اولیه مورد نیاز است ، باید احتیاط شود ، زیرا تخریب آن باعث تجمع آمونیاک می شود و آمونیاک می تواند بر برخی از رده های سلولی اثر سو بگذارد.

غلظت L-glutamine برای محیط کشت سلولی پستانداران می تواند از 0.68 میلی متر در متوسط ​​199 تا 4 میلی متر در Dulbecco’s Modified Eagles’s Medium باشد. محیط کشت سلول بی مهرگان می تواند به اندازه 12.3 میلی لیتر L-گلوتامین باشد. مکمل هایی مانند گلوتاماکس پایدارتر هستند و می توانند جایگزین گلوتامین برای کشت طولانی مدت سلول های کند شوند.

همچنین ممکن است اسیدهای آمینه غیر ضروری به محیط اضافه شود تا جایگزین آنهایی شود که در طول رشد تخلیه شده اند. مکمل محیط با اسیدهای آمینه غیر ضروری رشد را تحریک کرده و ماندگاری سلول ها را طولانی می کند.

 

کربوهیدرات ها

کربوهیدرات ها به شکل قندها منبع اصلی انرژی هستند. بیشتر رسانه ها حاوی گلوکز و گالاکتوز هستند ، با این حال ، برخی حاوی مالتوز و فروکتوز هستند.

 

پروتئین ها و پپتیدها

پروتئین ها و پپتیدهایی که بیشتر مورد استفاده قرار می گیرند آلبومین ، ترانسفرین و فیبرونکتین هستند. از اهمیت ویژه ای در محیط های بدون سرم برخوردارند. سرم منبع غنی پروتئین است و شامل آلبومین ، ترانسفرین ، آپروتینین ، فتوئین و فیبرونکتین است. آلبومین پروتئین اصلی در خون است که برای اتصال آب ، نمک ها ، اسیدهای چرب آزاد ، هورمون ها و ویتامین ها و انتقال آنها بین بافت ها و سلول ها عمل می کند. ظرفیت اتصال آلبومین ، آن را به عنوان ماده پاک کننده مناسبی از مواد سمی از محیط کشت سلولی ساخته است.

آپروتینین یک عامل محافظ در سیستم های کشت سلولی است. در pH خنثی و اسیدی پایدار است و در برابر دماهای بالا و تخریب توسط آنزیم های پروتئولیتیک مقاوم است. این توانایی مهار چندین پروتئیناز سرین مانند تریپسین را دارد. Fetuin گلیکوپروتئینی است که در سرم جنین و نوزاد در غلظت های بیشتری نسبت به سرم بزرگسالان یافت می شود. همچنین مهار کننده پروتئینازهای سرین است. فیبرونکتین یکی از عوامل اصلی در پیوست سلول است. ترانسفرین یک پروتئین حمل و نقل آهن است که برای تأمین آهن غشای سلول عمل می کند.

 

اسیدهای چرب و چربی ها

از آنجا که به طور کلی در سرم وجود دارند از اهمیت ویژه ای در محیط های بدون سرم برخوردارند.

 

ویتامین ها

بسیاری از ویتامین ها برای رشد و تکثیر سلول ها ضروری هستند. ویتامین ها به مقدار کافی توسط سلول ها قابل سنتز نیستند و بنابراین مکمل های مهم مورد نیاز در کشت بافت هستند. دوباره سرم منبع اصلی ویتامین ها در کشت سلول است ، با این حال ، محیط نیز با ویتامین های مختلف غنی شده و آنها را برای یک رده سلولی خاص مناسب می کند. ویتامین های گروه B معمولاً برای تحریک رشد اضافه می شوند.

 

عناصر کمیاب

عناصر کمیاب اغلب به محیط بدون سرم اضافه می شوند تا جایگزین عناصر معمول سرم شوند. عناصر کمیاب مانند واسطه های مس ، روی ، سلنیوم و اسید تری کاربوکسیلیک عناصر شیمیایی هستند که برای رشد مناسب سلول به مقادیر اندک نیاز دارند. این ریز مغذی ها برای بسیاری از فرایندهای بیولوژیکی ضروری است ، به عنوان مثال ، برای حفظ عملکرد آنزیم ها.

 

مکمل ها

محیط رشد کاملی که برای برخی رده های سلولی توصیه می شود ، به اجزای اضافی نیاز دارد که در محیط پایه و سرم وجود ندارد. این اجزا ، مکمل ها ، به حفظ تکثیر و حفظ متابولیسم طبیعی سلول کمک می کنند. اگرچه مکمل هایی مانند هورمون ها ، فاکتورهای رشد و مواد سیگنالینگ برای رشد طبیعی برخی از رده های سلولی مورد نیاز است ، اما همیشه بهتر است اقدامات احتیاطی زیر انجام شود: در سلول ها ، همیشه بهتر است که بعد از افزودن مکمل ها ، اسمولالیته را دوباره بررسی کنید. برای بیشتر رده های سلولی ، اسمولالیته مطلوب باید بین 260 mOSM / kg و 320 mOSM / kg باشد.

ماندگاری محیط رشد پس از افزودن مکمل ها تغییر می کند. محیطهای کامل حاوی مکمل پروتئین تمایل دارند سریعتر از محیط پایه به تنهایی تخریب شوند.

 

آنتی بیوتیک ها

اگرچه برای رشد سلول مورد نیاز نیست ، اما آنتی بیوتیک ها اغلب برای کنترل رشد آلودگی های باکتریایی و قارچی استفاده می شوند. استفاده معمول از آنتی بیوتیک برای کشت سلول توصیه نمی شود زیرا آنتی بیوتیک ها می توانند آلودگی توسط مایکوپلاسما و باکتری های مقاوم را پنهان کنند. علاوه بر این ، آنتی بیوتیک ها همچنین می توانند در متابولیسم سلول های حساس تداخل ایجاد کنند.

 

کاربرد سرم در محیط کشت چیست ؟

سرم ترکیبی پیچیده از آلبومین ها ، فاکتورهای رشد و بازدارنده های رشد است. سرم یکی از مهمترین اجزای محیط کشت سلولی است و به عنوان منبع اسیدهای آمینه ، پروتئین ها ، ویتامین ها (به ویژه ویتامین های محلول در چربی مانند A ، D ، E و K) ، کربوهیدرات ها ، لیپیدها ، هورمون ها ، فاکتورهای رشد عمل می کند. محیط رشد طبیعی غالباً شامل 10٪ سرم است.

به دلیل وجود عوامل رشد و مهارکننده ها ، نقش سرم در کشت سلول بسیار پیچیده است. متأسفانه ، علاوه بر خدمت به عملکردهای مختلف ، استفاده از سرم در برنامه های کشت بافت دارای اشکالات متعددی است.

محیط کشت گیاهی

 

انواع محیط کشت

محیط کشت برای کاربردهای خاص زیادی از قبیل تسهیل تشخیص، شمارش و جداسازی انواع خاصی از سلولهای استفاده میشود. برای رسیدن به این کاربردها، تعداد بسیار زیادی از محیطهای کشت موجود هستند.

 

محیط کشت عمومی/پایه(General purpose media/ Basic media)

این محیط های کشت به نسبت دیگر محیط ها ساده تر هستند و حاوی آب و مواد مغذی هستند. معمولا از آنها برای جداسازی اولیه سلولها و میکروارگانیسم ها استفاده میشود.

 

محیط کشت غنی(Enriched medias)

به این محیط های کشت فاکتور رشد نیز اضافه شده است. به محیطهای کشت غنی مواد مغذی اضافه تری به شکل خون یا سرم اضافه میشود. از این محیطهای کشت برای رشد سلولها استفاده میشود. آگار خون، آگار شکلات و سرم لوفلر تعدادی از محیطهای کشت غنی هستند.

 

محیط کشت انتخابی و غنی(Selective and enrichment media)

این نوع محیط کشت برای منع و جلوگیری از رشد باکتریهای آلوده کننده و بازیابی پاتوژن از ترکیبی از باکتری ها استفاده میشود. اگرچه محیط کشت های انتخابی برپایه آگار هستند و محیط کشت های غنی مایع هستند، اما هر دو آنها هدف یکسانی دارند. محیط کشت های آگار میتوانند با اضافه کردن عامل های منع کننده ای که به پاتوژنهای خاصی آسیب نمی رسانند، انتخابی شوند. این عاملها عبارت از آنتی بیوتیک ها، رنگ ها، مواد شیمیایی و pH هستند. از ترکیب تمام اینها نیز استفاده میشود.

مثالهایی از محیط کشت انتخابی:

محیط کشت تمایزی(Differential/ indicator medium)

این محیط کشت ها جوری طراحی شده اند که باکتری های متفاوت می توانند بر اساس رنگ کلونیشان تشخیص داده شوند. این محیط های کشت اجازه رشد انواع مختلفی از یاخته ها(سلولها) را میدهند اما از نظر شکل کلونی آنها قابل تمییز است.

 

محیط کشت ترابری(Transport media)

نمونه های بالینی باید بلافاصله پس از جمع آوری و برای جلوگیری از رشد بیشتر آنها یا آلوده شدن به آزمایشگاه منتقل شوند. برای اینکار از محیط کشت های ترابری استفاده میشود. این محیط ها از خشک شدن نمونه و رشد بیش از حد باکتری های ناخواسته جلوگیری میکنند. اضافه کردن ذغال باهث خنثی شدن عوامل منع کننده می شود.

محیط کشت بی‌هوازی(Anaerobic media)

باکتری های بی هوازی برای رشد نیاز به محیط خاصی با مقادیر کمی از اکسیژن دارند.

 

محیط کشت سنجش(Assay media)

این محیط ها برای سنجش ویتامین ها، اسیدهای آمینه و آنتی بیوتیک ها استفاده میشوند.

 

منابع :

Bacterial culture through selective and non-selective conditions

Cell Culture Media

5/5 - (1 امتیاز)
اشتراک گذاری:

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *